本作の痛快なドラマを支えているのが、タウンズヴィルを舞台に暴れ回る強烈な悪党（ヴィラン）とユニークな脇役たちです。
【ガールズ最大の宿敵：モジョ・ジョジョ（Mojo Jojo）】
緑色の顔に露出した巨大な脳みそ、白と紫のマントをまとった猿の天才科学者。かつてはユートニウム博士の助手猿「ジョジョ」でしたが、ガールズ誕生の実験事故でケミカルXを浴びて超知能を獲得し、悪の道へ堕ちました。同じ言葉を何度も繰り返す独特の喋り方と、回りくどい世界征服計画が特徴です。日本語版は名優・石井康嗣（新版は武田幸史）が演じ、憎めない悪役として絶大な人気を誇ります。
【悪夢の悪魔：カレ（HIM）】
あまりの恐ろしさに本名を口にすることすら禁じられている、オネエ言葉を使う謎の悪魔。赤い肌にロブスターのようなハサミの手、黒いチュチュを身にまとい、心理戦や悪夢でガールズを精神的に追い詰めます。
【ボーイズ版パワーパフ：ラウディラフボーイズ（The Rowdyruff Boys）】
刑務所に収監されたモジョ・ジョジョが、犬の尻尾やスナイパーの皮、トイレの水を材料に「ケミカルX」ならぬ「モジョのエキス」で創り出した最凶の男の子3人組。
- ブリック（Brick / 赤）：ブロッサムの対となる短気で横暴なリーダー。
- ブーマー（Boomer / 青）：バブルスの対となるおバカで能天気な少年。
- ブッチ（Butch / 緑）：バターカップの対となる凶暴で落ち着きのない狂犬タイプ。
ガールズを力で圧倒するほどの戦闘力を持ちながら、女の子からの「キス」に極端に弱く爆発してしまうという弱点を持っています。
その他にも、毛むくじゃらの田舎者ファジー・チョプキンス、大富豪のワガママ娘プリンセス・モアバックス、無害すぎる犯罪集団アメーバ・ボーイズ、そしてガールズの優しい生みの親ユートニウム博士や、ピクルスが大好物のタウンズヴィル市長など、一度見たら忘れられない面々が脇を固めています。
