なぜ三毛猫にはメスしか生まれないのか。この疑問を解き明かす鍵は、猫の毛色を決定する遺伝子と性染色体の組み合わせにあります。
猫の性別を決定する染色体は、メスが「XX」、オスが「XY」です。毛色を黒にする遺伝子や白にする遺伝子とは異なり、オレンジ（茶色）を発色させる「O（Orange）遺伝子」は、メスを決めるX染色体の上にのみ存在します。このO遺伝子には、オレンジ色を発現させる優性遺伝子「O」と、オレンジ色を発現させない（黒系になる）劣性遺伝子「o」の2種類が存在します。
白毛を作る遺伝子は常染色体上にあるため、白・黒・茶の3色が同時に揃うためには、1頭の猫が「O（茶）」と「o（黒）」という2つの対立遺伝子を同時に持たなければなりません。つまり、X染色体を2本持つ「XX（メス）」で、かつ遺伝子型が「Oo」というヘテロ接合体になった場合のみ、細胞分裂の過程でランダムにどちらかのX染色体が不活性化（ライオニゼーション）され、黒と茶がまだら模様となって現れます。これが、三毛猫が原理的にメスしか生まれない遺伝学的な理由です。
通常、オスの染色体は「XY」であるため、持てるX染色体は1本だけです。「OY（茶＋白）」か「oY（黒＋白）」のどちらか一方にしかなり得ず、正常な染色体を持つオスが3色を持つことは理論上不可能です。
それでも極めて稀にオスの三毛猫が誕生するのは、以下のような遺伝子異常や細胞の変異が起きた場合に限られます。
1. クラインフェルター症候群（XXY）
減数分裂時の不分離により、本来2本であるはずの性染色体が「XXY」という3本の組み合わせになる現象です。X染色体を2本持つため、メスと同じように「Oo」の遺伝子を持つことが可能となり、同時にY染色体によって外見や生殖器がオスとして発達します。オスの三毛猫の大多数はこのタイプです。
2. モザイク・キメラ現象（XX/XYなど）
受精卵が分裂する初期段階で異なる遺伝情報を持つ細胞が混ざり合ったり、本来双子になるはずだった2つの受精卵（XXとXY）が母胎内で1つに融合して1頭の個体として誕生する現象です。この場合、極めて複雑な遺伝子構成を持ちながらオスの三毛猫として発現します。
これらの遺伝的変異が発生する確率は、国内外の獣医学研究データによるとおよそ1,000頭から30,000頭に1頭（約0.003%〜0.1%）とされています。外見が完全な三毛猫であり、かつ健康に育つ個体に限定すると実質的な出現率は約3万分の1とも言われ、まさに天文学的な確率が生み出す生物学的奇跡と呼ばれています。
