新選組の前身である「壬生浪士組」が発足した際、芹沢鴨は新選組の筆頭局長として近藤勇や新見錦の上に立つ最高指導者でした。しかし結成からわずか半年後の文久3年（1863年）9月、彼は突如として内部粛清されます。この暗殺劇に至った理由は、一般に知られる「手のつけられない暴君の排除」という単純な構図だけでは説明がつきません。
芹沢鴨の暗殺理由は、大きく分けて3つの要因が複雑に絡み合っていました。
第一に、京都守護職を務める会津藩主・松平容保からの密命です。壬生浪士組は会津藩のお預かりとして市中警備の任に就いていましたが、芹沢派が引き起こす治安悪化行為は、治安維持組織としての正当性を根底から揺るがしていました。会津藩の公用方記録や当時の側近の手記によれば、町民や朝廷からの苦情に苦慮した会津藩首脳部が、近藤勇に対して「芹沢を内々に処置せよ」との意向を伝えたことが、決定的な引き金となりました。
第二に、近藤勇・土方歳三との組織統制をめぐる深刻な路線対立です。近藤らは浪人集団を幕府直属の規律ある軍事組織へと脱皮させようと試民規約（後の局中法度）の徹底を図っていました。一方、芹沢は自由奔放な攘夷志士の気風を崩さず、隊の規律を公然と破り続けました。組織の私物化を許せば隊そのものが瓦解するという危機感が、土方歳三に暗殺の謀略を決意させたのです。
第三に、財政調達を口実にした不法行為の激化です。隊の運営資金を用立てない京都の豪商に対し、力づくで強請を行う手法は、壬生浪士組の評判を著しく失墜させました。特に後述する生糸問屋「大和屋」への焼き討ち事件は、会津藩の面子を完全に潰す暴挙であり、もはや弁解の余地のない死刑宣告に等しい契機となりました。
