『LIFE!』における女性キャストの扱いは、従来のバラエティ番組における「女性タレントのマスコット的配置」とは一線を画しています。一流の女優が本気でコメディの土俵に上がり、間（ま）と演技力で笑いを取りにいく姿勢が一貫して貫かれてきました。
初期の礎を築いた西田尚美は、どんな不条理な設定でも日常の延長として演じ切るリアリズムでコントの説得力を支えました。また、石橋杏奈の抜群のコメディエンヌぶりや、臼田あさ美の体当たり演技、そして途中加入した吉田羊が見せた凛とした美しさとコミカルなギャップは、番組の上品なトーンを決定づけました。
季節特番体制へ移行して以降は、以下の豪華女優陣が各回を華やかに彩っています：
- 木村多江：『LIFE! 夏』等で見せた、しっとりとした佇まいからの凄絶なキレ芸・ハイテンションコント。
- 江口のりこ・池谷のぶえ：圧倒的な演技力と存在感で、じろうや内村と繰り広げる重厚な会話劇コント。
- 西野七瀬・上白石萌歌・川栄李奈：若手実力派として、芸人顔負けの鋭いツッコミや変顔も厭わない全力の演技。
- 吉住：女性ピン芸人としての卓越した人間観察眼を活かし、女優陣と対等に渡り合うコントを披露。
